? ? ? ? ?病原微生物是指可以侵犯人體，引起感染甚至傳染病的微生物，或稱病原體。病原體種類非常多，包括病毒、細(xì)菌、真菌和其他微生物等。
在科研方面，微生物學(xué)檢測(cè)已經(jīng)成為分子生物學(xué)創(chuàng)立的支柱之一，基因工程、生物工程、遺傳生物學(xué)的創(chuàng)立與發(fā)展都離不開(kāi)微生物學(xué)的基礎(chǔ)；在臨床方面，基于病原學(xué)證據(jù)的抗感染治療也將病原微生物檢測(cè)視為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于改善患者病情與預(yù)后，預(yù)防和控制環(huán)境感染有著重大的意義。
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微生物檢測(cè)技術(shù)縱覽
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我們獲得的樣本中，一般都會(huì)存在多種細(xì)菌，此時(shí)需要將樣本進(jìn)行分離培養(yǎng)，一般分為平板分離培養(yǎng)或血培養(yǎng)。
當(dāng)平板培養(yǎng)或血培養(yǎng)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，需要進(jìn)行微生物鑒定。鑒定一般分為三個(gè)層次，其一為菌落形態(tài)鑒定，其二為染色鏡檢鑒定，其三為生化鑒定，三者聯(lián)合進(jìn)行結(jié)果判斷。而當(dāng)陽(yáng)性樣本出現(xiàn)多菌種時(shí)，需要重新采樣進(jìn)行分離培養(yǎng)及純化培養(yǎng)。
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1 染色鏡檢
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病原微生物體形微小，大多無(wú)色半透明狀，若是肉眼觀察菌落形態(tài)還無(wú)法判斷的話可將其染色后可借助顯微鏡觀察其大小、形態(tài)、排列等，能夠?qū)τ谛螒B(tài)特殊的病原體進(jìn)行直觀的檢查，不需要特殊的儀器和設(shè)備。
2 生化鑒定
? ? ? 生化方法檢測(cè)病原微生物實(shí)際上是測(cè)定微生物特異性酶。由于各種微生物所具有的酶系統(tǒng)不完全相同，對(duì)許多物質(zhì)的分解能力亦不一致。因此可利用不同底物產(chǎn)生的不同代謝產(chǎn)物來(lái)間接檢測(cè)該微生物內(nèi)酶的有無(wú)，從而達(dá)到檢測(cè)特定微生物的目的。
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基因?qū)用娴臋z測(cè)技術(shù)能夠改善傳統(tǒng)檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)用外部形態(tài)和生理特征進(jìn)行檢測(cè)的現(xiàn)狀，能夠采用特有的基因片段序列對(duì)病原微生物的種類進(jìn)行鑒別，所以基因檢測(cè)技術(shù)以其自身獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)被臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。
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1 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)
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聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一種在體外是用已知寡核苷酸引物引導(dǎo)未知片段中微量待測(cè)基因片段并進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)。由于PCR可以對(duì)待測(cè)基因進(jìn)行擴(kuò)增，特別適用于病原體感染早期的診斷。PCR技術(shù)在近20年里發(fā)展迅速，從基因擴(kuò)增到基因的克隆和改造以及遺傳分析，可靠性逐步提高。
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溫江醫(yī)學(xué)城·分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室 |
QuantStudio3?熒光實(shí)時(shí)定量分析系統(tǒng) |
2 基于16S rRNA的檢測(cè)技術(shù)
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隨著測(cè)序技術(shù)發(fā)展，DNA大規(guī)模測(cè)序得以進(jìn)行，現(xiàn)階段各種常見(jiàn)細(xì)菌的16S rRNA基因幾乎全部測(cè)序完成，它們相對(duì)穩(wěn)定且有較高的拷貝數(shù)(每個(gè)細(xì)胞幾千個(gè)拷貝)，其序列中含可變區(qū)及高度保守區(qū)，因此可設(shè)計(jì)群、屬、種特異性的探針。
16S rRNA編碼基因的這些特點(diǎn)使之成為較理想的細(xì)菌基因分類的靶序列，逐漸成為細(xì)菌鑒定、分類的熱門檢測(cè)技術(shù)。16SrRNA檢測(cè)技術(shù)利用現(xiàn)有病原菌標(biāo)準(zhǔn)菌株制作DGGE(變性梯度凝膠電泳)標(biāo)準(zhǔn)marker，然后對(duì)疑似“病原菌”擴(kuò)增16SrRNA進(jìn)行DGGE分析，這樣可以做到快速檢測(cè)。
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基因簇（KO）豐度熱圖 |
種水平的精細(xì)組成圖 ? |
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1 血清學(xué)檢測(cè)
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采用血清學(xué)檢測(cè)能夠?qū)Σ≡⑸镞M(jìn)行快速鑒定，血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理是通過(guò)已知的病原體抗原以及抗體對(duì)病原體進(jìn)行檢測(cè)，與傳統(tǒng)的細(xì)胞分離培養(yǎng)相比，血清學(xué)檢驗(yàn)的操作步驟簡(jiǎn)單，其常用的檢測(cè)方法之一則為酶聯(lián)免疫測(cè)試技術(shù)等。酶聯(lián)免疫測(cè)試技術(shù)的應(yīng)用能夠大幅度提高血清學(xué)檢測(cè)的敏感性和特殊性，不僅能夠?qū)z測(cè)樣本中的抗原進(jìn)行檢測(cè)，還能夠檢測(cè)抗體成分。
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酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)室 |
全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 |
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2 藥敏實(shí)驗(yàn)
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傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)一般分為紙片擴(kuò)散法、稀釋法、快速藥敏 E-test三種方法，判定標(biāo)準(zhǔn)為最低抑菌濃度MIC值和抑菌圈直徑KB值。
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制片擴(kuò)散法：
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紙片擴(kuò)散法是將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測(cè)試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴(kuò)散，隨著擴(kuò)散距離的增加，抗菌藥物的濃度呈對(duì)數(shù)減少，從而在紙片的周圍形成濃度梯度。同時(shí)，紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的菌株不能生長(zhǎng)，而抑菌范圍外的菌株則可以生長(zhǎng)，從而在紙片的周圍形成透明的抑菌圈，不同的抑菌藥物的抑菌圈直徑因受藥物在瓊脂中擴(kuò)散速度的影響而可能不同，抑菌圈的大小可以反映測(cè)試菌對(duì)藥物的敏感程度，并與該藥物對(duì)測(cè)試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)。
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稀釋法：
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稀釋法藥敏試驗(yàn)可用于定量檢測(cè)待測(cè)細(xì)菌對(duì)待驗(yàn)證抗菌藥物的抗藥性或敏感性，分為瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法。實(shí)驗(yàn)時(shí)，抗菌藥物的濃度通常經(jīng)過(guò)倍比稀釋，能抑制待測(cè)菌肉眼可見(jiàn)生長(zhǎng)的最低藥物濃度成為最小抑菌濃度（MIC），一個(gè)特定抗菌藥物的測(cè)試濃度范圍應(yīng)該包含能夠檢測(cè)細(xì)菌的解釋性折點(diǎn)（敏感、中介和耐藥）的濃度，同時(shí)也應(yīng)該包含質(zhì)控參考菌株的MIC。
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抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果1-常量肉湯稀釋法
注：圖A直接觀察；圖B加TTC試劑染色觀察
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? ? ? 除此之外，免疫學(xué)技術(shù)、多重PCR技術(shù)、核酸雜交技術(shù)、基因芯片技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、鏈置換擴(kuò)增技術(shù)、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)、宏基因組測(cè)序技術(shù)(mNGS)、靶向基因組測(cè)序技術(shù)(tNGS)、質(zhì)譜分析技術(shù)也被大量應(yīng)用于微生物檢測(cè)中。隨著人類對(duì)于病原微生物的檢測(cè)手段的不斷升級(jí)，希望對(duì)于將來(lái)生命科學(xué)行業(yè)有著新的啟示。
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